顯微鏡相關知識
用于顯微注射用的顯微鏡常使用具有相差(phasecontrast) 與微分干涉(differential interference contrast) 功能的倒置顯微鏡( 例如奧林巴斯的倒置顯微鏡IX 系列) 。
倒置顯微鏡組成和普通顯微鏡一樣,只不過物鏡與照明系統顛倒,一般正置顯微鏡的物鏡在載物臺之上,照明系統在下,而倒立式顯微鏡為物鏡在下,照明系統在載物臺之上。倒置顯微鏡的優點為物鏡與目鏡間的工作距離較長,可直接將培養皿置于顯微鏡操作臺上進行顯微注射等工作。
傳統的普通光學顯微鏡無法直接觀察未經染色的透明活細胞,為了能讓顯微注射技術觀察與操作透明的活細胞樣品,顯微鏡必須使用具有相差與微分干涉功能的倒置顯微鏡。
相差顯微鏡是由P.Zernike 于1932 年發明的,并因此獲得1953 年諾貝爾物理獎。這種顯微鏡*大的特點是可以觀察未經染色的透明標本和活細胞。相差顯微鏡的基本原理是利用透明細胞檢體內部折射率的各不相同,把透過標本的可見光的光程差變成振幅差,從而提高了各種結構間的對比度,得到明暗對比的效果,使得透明活細胞各種結構內部細節在亮背景視野中變得清晰可見。
相差顯微鏡的基本構造是利用相差聚光鏡及內部相環所構成的環狀光圈,當光通過聚光鏡后,產生中空光錐,并在光線穿過檢體后發生折射,偏離了原來的光路,同時被延遲了 1/4λ (波長),如果再經過物鏡內的光延遲位環板而成增加或減少1/4λ ,則光程差變為1/2λ ,兩束光合軸后干涉加強,振幅增大或減小提高反差。
雖然相差顯微鏡可以為透明的細胞樣品提供清晰的觀察圖像,但是一般相差顯微鏡的缺點是會有“光暈”現象產生。因而導致觀察的景深受限制,無法用來觀察較厚的樣品。較厚的細胞團區域在一般相差顯微鏡下的清晰度十分糟糕,而且邊緣常產生暈輪效果,如果觀察樣品中有超過 85% 以上的區域為較厚細胞時,這個問題將非常嚴重。然而顯微注射的樣品如受精卵細胞或細胞團均具有一定厚度,造成細胞結構和邊緣無法清楚可見,因此顯微注射用的顯微鏡必須要能克服厚樣品的問題。
為解決活動樣品和厚樣品帶有“光暈”的觀察問題,1952 年,Nomarski 在相差顯微鏡原理的基礎上發明了微分干涉差顯微鏡(differential interference contrast microscope )。Nomarski 微分干涉差顯微鏡的優點是能顯示結構的三維立體投影影像。與傳統相差顯微鏡相比,其標本可略厚一點,折射率差別更大,故影像的立體感更強,產生類似于浮雕的效果。
微分干涉差顯微鏡技術設計比相差顯微鏡要復雜得多,Nomarski DIC 利用的是偏振光,具有四個特殊的光學組件:偏振器(polarizer )、DIC 棱鏡、DIC 滑行器和檢偏器(analyzer )。偏振器直接裝在聚光系統的前面,使光線發生線性偏振。在聚光器中則安裝了二個楔形單軸的晶體 , 如石英, 以光軸互相交錯的方式互相接合,稱為Wollaston 棱鏡或Nomarski 棱鏡,即DIC 棱鏡。此棱鏡可將每一光線分離成為二條偏振互相垂直的兩束光(x 和y ),二者成一小夾角,聚光器將兩束光調整成與顯微鏡光軸平行的方向。*初兩束光相位一致,在穿過標本相鄰的區域后,由于標本的厚度和折射率不同,引起了兩束光發生了光程差。在物鏡的后焦面處安裝了**個 Wollaston 棱鏡,即DIC 滑行器,它把兩束光波合并成一束,這時兩束光的偏振面(x 和y )仍然存在。*后光束穿過**個偏振裝置,即檢偏器,在光束形成目鏡DIC 影像之前,檢偏器與偏光器的方向成直角,檢偏器將兩束垂直的光波組合成具有相同偏振面的兩束光,從而使二者發生干涉。 x 和y 波的光程差決定著透光的多少,當光程差值為0 時,沒有光穿過檢偏器;光程差值等于波長一半時,穿過的光達到*大值,于是在灰色的背景上,標本結構便呈現出亮暗差。為了使影像的反差達到*佳狀態,觀察者可通過調節 DIC 滑行器的縱行微調來改變光程差,改變光程差可以改變影像的亮度。而調節DIC 滑行器則可使標本的細微結構呈現出正或負的投影形象,通常是一側亮,而另一側暗,這便造成了標本的人為三維立體感,產生了類似大理石上的浮雕感覺。 DIC 顯微鏡使細胞的內部結構,特別是一些較大的細胞器,如核、線粒體等,立體感特別強,因此適合應用于顯微操作技術。目前像基因注入、核移植、轉基因等的顯微操作常需要在這種顯微鏡下進行。
雖然 Nomarski 微分干涉技術可以對付一些細胞團或者組織等較厚的樣品,但它非常昂貴,并且僅僅只能應用在玻璃底的培養皿中,無法直接在廣為研究人員進行細胞培養操作的一般塑料材質的培養皿產生浮雕效果,此外這種技術對于顯微操作技術的所使用的樣品而言,景深還是稍嫌不足,因此在應用上遇到不少問題。有鑒于此,一些其它的可以用于觀察厚樣品的微分干涉技術也逐漸被開發出來。例如 OLYMPUS 奧林巴斯公司就推出了自己的浮雕相襯( RC )裝置奧林巴斯浮雕相襯系統能夠產生高反差的 3D 圖像,類似于 DIC 效果,可用于塑料器皿中的樣品。浮雕相襯用于細胞受精,使細胞核膜更容易看到和穿刺。適用于所有類型的細胞 , 組織 ( 無論活體 , 染色 , 未染色 ), 晶體表面細節 , 透明聚合物 , 玻璃和其它類似材料 , 尤其適應于顯微操作實驗。