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綠色熒光蛋白嵌合體小鼠的建立和鑒定
日期：2025-04-18 19:12
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摘要：
摘 要 為研究嵌合體動物中供體胚胎干細胞( ES) 在宿主胚胎發育中的走向和定位, 同時探討綠色熒光蛋白(GFP)基因作為報告基因在轉基因動物制作中的應用價值, 本研究將p EGFP2N1 基因導入小鼠ES2D3細胞系,得到穩定表達GFP的胚胎干細胞亞系ES2D32GFP , 通過對昆明小鼠的囊胚腔注射, 獲得了4只表達綠色熒光蛋白的嵌合體小鼠。其中1 只存活至成年,3 只出生時死亡。熒光顯像及組織PCR檢測顯示了綠色熒光蛋白在小鼠體內的嵌合情況。以綠色熒光為指標可實現活體水平的動態觀察,本實驗**觀察到以GFP為指標所示的機體嵌合情況與根據毛色嵌合推測的機體嵌合情況存在很大差異, 以GFP 為嵌合指標更加**而準確;但不排除GFP對小鼠發育存在一定毒性的可能; 另外, 有結果顯示供體ES 細胞在宿主體內除了大片補丁狀嵌合外,還存在細胞散在嵌合的情況,后者提示了在組織中利用GFP 對ES細胞實施單細胞追蹤和實時觀察的可行性,為胚胎發育和**發生的相關研究提供了新的觀察方法..
ES 細胞介導的轉基因動物制作途徑建立于1986 年( Robert son et al. , 1986 ; Gossleretal.1986) , 嵌合體動物的獲得是實現ES 細胞途徑的決定性步驟(Auerbach et al. , 2000),其中一個重要問題是嵌合狀態的分析, 即如何將嵌合體中ES來源部分同宿主部分區別開來。*初用毛色作為嵌合指標,但此方法對內臟的嵌合無法分析(Hooper etal. , 1987 ; Nagyet al. , 1993) , 現在常用LacZ 報告基因法( Yvan and Philippe , 1990 ; Suemorietal. , 1990 ; Woodet al. , 1993) 和GPI 同功酶電泳法(Nagy et al. , 1993 ;Beddington andRobert son ,1989) 標記ES 細胞, 可以檢測內臟的嵌合, 卻需破壞機體致其死亡,無法對同一活體進行動態研究,而且檢測技術要求高, 方法復雜。GFP 作為一種獨特的報告蛋白,無需抗體、輔助因子、酶底物等其他成分的參與,在熒光顯微鏡的藍光激發下, 發出綠色熒光(Chalfie et al. , 1994),其*大優點在于它在活細胞內的示蹤作用。建立綠色熒光蛋白嵌合體小鼠,可以在熒光顯微鏡下透過皮膚見到高強度熒光,達到在活體水平上對內臟嵌合進行直接觀察的目的, 克服了以往方法的缺點。英國和加拿大實驗室(Zerncka2Goetz et al., 1997 ; Ha2diantonakis et al. , 1998) 將表達GFP的ES 細胞
與8 - 16 細胞期胚胎聚合, 得到綠色熒光蛋白嵌合體小鼠,但未對出生嵌合體小鼠的嵌合狀態進行系統分析。國內在對ES細胞和嵌合體制作取得一定研究基礎后(冼美薇等, 1996 ; 陳偉勝等,1999 ;**等, 2001 ; 馬蕓、陳系古,2002) , 近年來開始將GFP 基因引入ES 細胞( 楊樺、傅繼良,2001 ;沈干等,2003) 。通過ES途徑建立表達GFP 的嵌合體小鼠在國內尚未見報道。我們將p EGFP2N1 基因轉入D3 小鼠ES細胞, 并進行ES細胞囊胚腔注射,得到ES 細胞介導的存活綠色熒光嵌合體小鼠, 以GFP 為報告蛋白對ES 細胞的嵌合情況進行觀察,同時進行未轉染GFP基因的ES2D3 細胞囊胚腔注射, 以此為對照, 探討GFP基因在小鼠體內表達的**性。
1 材料與方法
111 材料
11111 實驗動物和細胞系
ES2D3 細胞系, 昆明小鼠由中山大學實驗動物中心提供; 小鼠胚胎呈纖維細胞(MEF) 取自孕1215 d 昆明小鼠胚胎。
11112 實驗試劑
綠色熒光蛋白真核表達質粒p EGFP2N1 (N1 末端改進型熒光蛋白載體) 為Clontech公司產品;Lipofectin轉染試劑盒購自GBICO 公司, Bam H Ⅰ限制性內切酶試劑盒(目錄號MR0521)、RNaseA購自華美生物工程公司,DL15000Markers 試劑盒購自大連寶生物公司;DMEM 培養基和L IF購自GBICO公司胎牛血清購自杭州四季青公司; 胰酶、M16 、M2 培養液購自SIGMA 公司。
112 方法
11211 ES2D32GFP 細胞的建立和培養 采用脂質體介導法用質粒p EGFP2N1(N末端改進型熒光蛋白載體Clontech 公司) 轉染ES2D3 細胞。將10 μl質粒p EGFP2N1、Lipofectin分別溶于100μl 80μl
無血清DMEM 培養基中, 混合后加入800μl 無血清DMEM 培養基混勻, 滴加至ES2D3 細胞上, 加入轉染液后于37℃、5%CO2 培養箱內5 h 。棄轉染液, 換ES 培養液繼續培養(培養液為葡萄糖含量4 500 mg/ L 的DMEM 添加20%FBS、β2巰基乙醇011 mmol/ L 、L IF 1 000 IU/ ml、青霉素100IU/ ml 、鏈霉素100IU/ml) 。48 h 后消化接種至經MMC 處理過的MEF 上, 繼續培養24 h 后, 用濃度為300μg/ ml G418的ES細胞培養液篩選抗性克隆, 倒置熒光顯微鏡下挑取熒光*強的克隆, 命名為ES2D32GFP 細胞, 進行擴增培養。
11212 ES2D32GFP 細胞未分化狀態及多能性的鑒定 ①堿性磷酸酶檢測 采用Gomoriα2萘基磷酸
法進行染色。②體內成瘤實驗 將含有1 ×106 個ES 細胞懸液011 ml 接種于4 - 6周齡雄性裸小鼠腹股溝皮下,待腫物形成約5 周時處死裸鼠, 摘取腫物, 制作冰凍切片于熒光顯微鏡下觀察,常規石蠟切片HE染色作為對照。③體外胚體形成實驗 將ES 細胞消化成單細胞懸液, 加不含L IF的培養液在玻璃培養瓶內培養,每天搖晃培養瓶多次。
11213 囊胚的收集 注射用囊胚取自四周齡超排昆明母小鼠, 與同品系公鼠合籠, 見栓315 d (當日見栓為015d)時從**和輸卵管中收集胚胎,移入上覆石蠟油的M 16 培養液滴內, 于37 ℃、5 % CO2 孵箱內培養。
11214 囊胚腔注射 ① 實驗組 注射用細胞為ES2D3 細胞系轉染GFP 基因后傳代至7 - 15 代。
②對照組 注射用細胞為未轉染GFP 基因的ES2D3 細胞系在本實驗室傳代至15 - 25 代。注射前3h更換新鮮培養液,胰酶消化后制成單細胞懸液備用。將適量ES 細胞懸液和囊胚期胚胎移入M2 注射液滴內, 在顯微注射系統下,用持卵針固定囊胚,用注射針吸取ES 細胞, 從遠離內細胞團的滋養層部位進針, 每個囊胚注射ES 細胞10 - 12 個。
11215 嵌合胚胎的發育 注射后囊胚腔消失, 置于培養液中于孵箱中培養1 - 3 h , 待囊胚腔恢復后, 移入見栓215d的假孕母鼠**中進行培育。
11216 熒光成像 將注射后胚胎、出生小鼠、置于倒置熒光顯微鏡載物臺上進行熒光觀察。對于出
生后即死亡的嵌合體小鼠, 取部分部位做冰凍切片, 切片厚度20 μm。使用共聚集熒光顯微鏡觀察, 激發波長488 nm,發射波長507 nm。
11217 PCR 檢測 存活小鼠死亡后, 在其各臟器中隨機部分取材, 提取基因組DNA , 通過PCR 檢測GFP基因。以質粒pEGFP2N1 為模版, 設計引物P1 , 5′AAG TTA ACA TGG TGA GCA AGGGCG AGG3′; P2 ,5′AAC CTC TAC AAA TGTGGT ATG GCT G 3′, 擴增基因片段大小約為840bp。反應條件為95 ℃45 s , 56 ℃ 45 s , 72 ℃ 1min , 28 個循環, PCR 產物以2%的瓊脂糖電泳觀察。
2 結 果
211 ES2D32GFP 細胞系的鑒定
ES2D32GFP 克隆在倒置光鏡下呈島嶼狀隆起,邊緣整齊, 表面平滑, 結構致密,細胞間界限不清;熒光顯微鏡下可見克隆發出較強綠色熒光, 表面熒光強度均勻(圖版Ⅰ: 1A , 1B) ,傳代后熒光強度未見衰減;消化成單細胞懸液后, 細胞小、圓而亮, 幾乎所有單個ES 細胞均發出綠色熒光(圖版Ⅰ: 2A , 2B)。
ES2D32GFP 堿性磷酸酶染色陽性, 細胞克隆呈深黑色。成瘤實驗中,畸胎瘤顯示綠色熒光,腫瘤組織含有來源于三個胚層的多種細胞類型。胚體形成實驗中, 3 - 5 d 細胞團開始分層, 形成簡單類胚體,外層細胞大而松散,內層細胞小而緊密,6 - 12 d 分層增多, 出現囊胚腔, 成圓泡狀, 熒光顯微鏡下見整個胚體發出綠色熒光,胚體貼壁培養后2 -3 d , 細胞團周邊可自發分化為多種形態的細胞, 分化后胚胎仍有強熒光顯示。
212 ES 細胞囊胚腔注射和嵌合體小鼠的建立
ES 細胞囊胚腔注射(圖版Ⅰ: 3A , 3B) , 后于熒光顯微鏡下觀察,實驗組所有胚胎均有細胞顯示綠色熒光,對照組未見熒光。注射后囊胚腔消失,培養1 - 3 h 后部分胚胎囊胚腔恢復,移植入假母**中繼續發育, 孕期18 d左右。對囊胚存活率和產仔率用χ2 檢驗做統計學分析, 結果顯示, 轉染GFP基因組囊胚存活率和產仔率明顯低于未轉染GFP 基因組,兩者差異具有統計學意義( P1 < 0101 , P2 <0101) 。
213 嵌合體小鼠的熒光顯像
將剛出生小鼠置于熒光顯微鏡下觀察, 以未經操作的同齡昆明小鼠作為對照。鏡下可見實驗組中有4 只小鼠發出綠色熒光, 1 只存活,3只出生時死亡。4 只小鼠均在頭頸部、胸部、腹部、肢體部位發出綠色熒光,綠色部分呈塊狀或線條狀嵌合在未發光的黑暗部位中,對照組未見熒光(圖版Ⅰ:4A , 4B) 。
214 對存活嵌合體小鼠的觀察
存活的綠色熒光蛋白嵌合體小鼠在熒光鏡下發出明亮的綠色熒光,熒光部位分布在其頭部、胸部、腹部和尾尖。當此小鼠長毛后,在其頭頂部呈現一塊不規則形黑**斑, 胡須中有2 根為黑色,呈現出ES細胞來源的D3 小鼠毛色的嵌合,頭頂部的毛色嵌合位置與熒光顯微鏡下所見之綠色部位吻合(圖版Ⅰ: 5A , 5B)。此小鼠生長發育遲緩,三周齡時,體重、生長僅為同齡普通昆明小鼠的一半, 且前肢短小, 步態搖擺, 尾部兩處扭曲, 根部增粗,顯示有畸形發育。8 周齡時,與成年普通明母鼠1∶2 合籠, 但未見生育跡象。因被毛的折光對熒光成像的干擾,小鼠長毛后頭、胸、腹部的顯像受到影響,但被毛較少的尾尖在熒光顯微鏡下依然可見強烈的綠色熒光。小鼠出生四個月后死亡, 對其進行解剖,取各臟器于熒光顯微鏡下觀察,在腦、心、肺、肝、腸、腎、睪丸、肢體肌肉中均見綠色熒光部位的嵌合。
3 討 論
本實驗成功獲得了綠色熒光蛋白嵌合體小鼠,以熒光為指標在活體水平上對內臟嵌合狀態進行直接觀察。
外源ES 細胞在宿主胚胎中以單細胞嵌合的方式提示我們, 在胚胎發育和**發生的研究中, 可以利用GFP對ES細胞實施單細胞追蹤和實時觀察, 研究其分化或病變情況。此外, 如果證實在生殖系的嵌合中也存在外源ES細胞單細胞嵌合的情況,則以往對生殖系嵌合的檢查方法必須重新評估。值得指出的是, 對存活的嵌合體小鼠的觀察發現,以GFP為指標所示的機體嵌合情況與根據毛色嵌合推測的機體嵌合情況存在很大差異。以往認為,從外觀毛色的嵌合可以推斷內臟的嵌合情況,兩者之間存在正比關系,如果沒有毛色的嵌合則一定沒有內臟的嵌合(Hooper et al. ,1987) , 在我們的實驗中, 小鼠毛色的嵌合僅見于頭部,而熒光所示除了頭部相應的嵌合以外,在胸、腹、尾尖多處部位也存在來源于供體ES 細胞的組織的嵌合,這提示了單純以毛色的嵌合來判斷機體的嵌合狀態存在一定的局限性,以GFP 為指標則更加**而準確.（摘自動物學報）
